Platforma Trio WGS, istovremena analiza cijelog genoma djeteta i njegovih bioloških roditelja.

IDENTIFIKACIJA

bolesnika s moguće genetički uvjetovanom bolešću od strane nadležnog liječnika i dogovor s voditeljem projekta CroSeq o združenoj cjelogenomskoj analizi putem e-pošte [email protected]. Trio-WGS je test prvog izbora za:

  • nejasne bolesti,
  • rijetke bolesti,
  • djecu konsangvinih roditelja,
  • precizno fenotipizirane kohorte bolesnika s heterogenim bolestima (npr. RASopatije-Noonanov heterogeni spektar) itd.

INFORMIRANI PRISTANAK I PRIVOLA

Poželjna je suglasnost i potpis oba roditelja. Na obrascima je važno navesti datum rođenja i dob u godinama za sve ispitanike. U skladu s odobrenjem etičkog povjerenstva dužni smo prikupiti dvije skupine informiranih pristanaka i privola:

  • Zakladi “Mila za Sve”, nositelju projekta CroSeq-GenomeBank i
  • KBCu Zagreb, instituciji glavnog kliničkog istražitelja prof.dr.sc. Marija Ćuka.

Pritom smo dužni upoznati sudionike istraživanja s osnovnim načelima združene cjelogenomske analize Trio-WGS, informirati ih o prednostima i mogućim nedostacima, objektivnim dosezima i očekivanjima, zaštiti osobnih podataka i relevantnim pitanjima koja se mogu dodatno nametnuti. Kompletna administrativna dokumentacija projekta CroSeq je dostupna u elektroničkom obliku za diseminaciju i što je moguće bolju pripremu bolesnika i roditelja te međuinstitucijsku i međukolegijalnu suradnju (www.croseq.eu).

DETALJNA FENOTIPIZACIJA

ispitanika od strane nadležnog liječnika je važna odrednica uspješne analize genoma i interpretacije varijanti. Klasična pedijatrijska anamneza je neprocijenjiva. Poželjno je sastaviti strukturirani tekst o bolesniku na engleskom jeziku koji uključuje:

  • rodoslovno stablo,
  • obiteljsku anamnezu (slični bolesnici, poliletalitet, nerazjašnjeni uzroci smrti, učestali spontani pobačaji, srodstvo, slične tegobe u roditelja),
  • osobnu anamnezu (trudnoća, porod, rast i razvoj, posebno novorođenačko i dojenačko razdoblje, psihomotorički razvoj, antropometrijske mjere),
  • sadašnju bolest (početak u dobi od; vodeći ili prezentirajući simptom ili stanje, tijek bolesti i razvoj kliničke slike, pojava dodatnih simptoma u dobi od, opis relevantnih patoloških laboratorijskih i slikovnih pretraga, kratak popis urednih nalaza i potencijalnih dotadašnjih genetičkih analiza itd.).

Izuzetno je važno svakom fenotipu, simptomu ili nalazu dodijeliti standardizirani izraz HPO (The Human Phenotype Ontology, HPO) uz pomoć mrežne stranice HPO Terms. Pojedinačni simptom, fenotip ili nalaz je potrebno upisati u tražilicu i odabrati izraz HPO koji po Vašem ekspertnom mišljenju najviše odgovara stanju u vašeg bolesnika (npr. za epileptički napadaj jest potrebno odabrati najvjerniju opciju/tip/vrstu, npr.: Seizures HP:0001250; Focal seizures HP:0007359; Focal motor seizures HP:0011153; Dyscognitive seizures HP:0002384; Generalized seizures HP:0002197; itd). Pojedinačne izraze HPO je poželjno koristiti tijekom pisanja strukturiranog teksta o bolesniku na način da ih se upisuje redom navođenja njihovih fenotipskih korelata i to bez interpunkcije između simptoma/nalaza i priradajućeg izraza HPO (npr. “Patient presented with Hypoglycemia HP:0001943 and Seizures HP:0001250 at age of 2 month”). Precizno i detaljno opisani izrazi HPO su nam iznimno važni za sistematsko i strukturirano formiranje reprezentativnih obrazaca podataka koje koristimo za računalnu obradu, inžinjering, strojno istraživanje, povezivanje i korelaciju te razvoj baze golemih količina genomskih podataka.

PRIORITIZACIJA IZRAZA HPO

Poželjno je rednim brojem prioritizirati fenotipsku karakteristiku i pripadajući izraz HPO. Na temelju Vašeg ekspertnog mišljenja poredajte po patognomoničnosti/reprezentativnosti /predominantnosti/značajnosti/pojavnosti izraze HPO. Od ukupnog broja navedenih izraza HPO u Vašem strukturiranom tekstu o bolesniku odaberite i prioritizirajte rednim brojem njih pet (npr. 1. Hypotonia HP:0001252; 2. Motor delay HP:0001270; 3. Autistic behavior HP:0000729; itd.). Za prioritizaciju je arbitrarno odabrano pet vodećih i po važnosti poredanih simptoma/nalaza. Ovisno o složenosti kliničkog problema moguće je navesti i prioritizirati znatno više izraza HPO i to bez ograničenja. Tekst na engleskom jeziku o detaljnoj fenotipizaciji bolesnika i njegovoj obitelji te prioritizirane izraze HPO molimo poslati u jedinstvenom elektroničkom dokumentu s imenom datoteke: CroSeq-Ime djeteta-Prezime nadležnog liječnika i poslati e-poštom glavnom istraživaču [email protected].

UZORKOVANJE

se provodi u dnevnoj bolnici Klinike za Pedijatriju, KBC Rebro, Kišpatićeva 12, Zelena zgrada, prizemlje, kontakt osoba je magistra sestrinstva Marina Bedeković Sliško, mag.med.techn. (Telefon: +385-1-23 76 395). Uzorkuje se po jedna epruveta EDTA od 3 ml periferne krvi za svakog pojedinačnog ispitanika (1×3 ml EDTA za dijete; 1x3ml EDTA za majku; 1x3ml EDTA za oca = ukupno 3×3 ml EDTA epruvete s ljubičastim čepom ). Neposredno nakon uzorkovanja je poželjno zarotirati epruvetu kako bismo pospješili mješanje periferne krvi i antikoagulantnog sredstva EDTA. Molimo Vas da označite epruvet EDTA imenom i prezimenom ispitanika i datumom rođenja.

DEIDENTIFIKACIJA, ANONIMIZACIJA i KODIRANJE

uzoraka u skladu s GDPR te POHRANJIVANJE u hladnjak na +40C.

TRANSPORT

uzoraka na sobnoj temperaturi kurirskom službom u SAD uz svu popratnu dokumentaciju i administrativna odobrenja.

IZOLACIJA, EKSTRAKCIJA, PROVJERA KVALITETE I KONCENTRACIJE

zametne nDNA i mtDNA.

SEKVENCIRANJE CIJELOG GENOMA

na platformi Illumina NovaSeq 6000 (obuhvat genoma je >95%, prosječni obuhvat čitanja nuklearne nDNA je 40x, a mitohondrijske mtDNA 20x, očitanje je diploidno). Obuhvat od 100% gena i varijanti preporučenih od ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics).

VALIDACIJA OČITANJA I PROCJENA OBUHVATA

za svaku pojedinačnu varijantu uključujući SNV (Single Nucleotide Variant), CNV (Copy Number Variant) i kratke strukturne aberacije sekvencije nDNA i mtDNA (small del/dup/ins/indel).

PRIMARNA ANALIZA I PORAVNAVANJE

Human Seq referentna sekvencija Genome Build hg37 i filtracija.

SEKUNDARNE ANALIZE

i personalizirane računalne modifikacije očitanja i filtracije.

INTERPRETACIJA I KLASIFIKACIJA VARIJANTI

u skladu s pravilima ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics), in silico računalne kalkulacije i predikcije, usporedbe s dostupnim populacijskim i kliničkim biobazama podataka, segregacijske analize, harmonizacija, konsenzualni odabir uzročnih i vjerojatno uzročnih varijanti u genima koji su usko povezani s fenotipom djeteta (P, pathogenic; LP, likely pathogenic), varijanti nejasnog/konfliktnog značaja (VUS, Variant of Uncertain Significance) te vjerojatno benignih i benignih varijanti (LB, likely benign; B, benign).

IZVJEŠTAJ

o interpretiranim i klasificiranim uzročnim i vjerojatno uzročnim varijantama u djeteta (P, pathogenic; LP, likely pathogenic).

POPIS VARIJANTI NEJASNOG ZNAČENJA

za dijete (lista VUS, ali bez interpretacije i bez izvještavanja što je u skladu s preporukama ACMG).

POPIS SEKUNDARNIH VARIJANTI

u genima povezanim s fenotipom djeteta, a koji su ujedno i na popisu gena za sekundarno izvještavanje prema preporukama ACMG.

KONAČNA KLINIČKA DIJAGNOZA

u djeteta se postavlja konsenzusom liječničkog tima (nadležni liječnik, glavni istražitelj i suradnici projekta CroSeq) i to na temelju dvaju kriterija:

  • genomski kriterij – identifikacija uzročne varijante P/LP analizom Trio-WGS,
  • klinički kriterij – promišljanje liječničkog tima o genotipu u kontekstu fenotipa, prosuđivanje o njihovom uzročno-posljedičnom odnosu utemeljeno na principima dobre kliničke prakse i trenutno dostupnim informacijama i znanjima te zaključivanje u najboljem interesu djeteta.

SANGEROVO PCR POTVRDNO TESTIRANJE

za odabrane i/ili nejasne uzročne varijante L/LP.

KLINIČKO PREVENTIVNO ILI TERAPIJSKO DJELOVANJE

u skladu s rezultatima istraživanja te procijena kliničkog značaja i transformirajućeg učinka za dijete.

POHRANJIVANJE

deidentificiranih i anonimiziranih golemih količina genomskih podataka svih ispitanika u CroSeq-GenomeBank biobanku specifičnih varijanti za zdravu populaciju RH i za otkrivene bolesti s disfunkcijom kodirajućih i nekodirajućih regija genoma. GenomeBank je kibernetički zaštićena i GDPR fully complaient biobaza u skladu s preporukama nadležnih regulatornih tijela.

MOGUĆNOST UDRUŽIVANJA SA MEĐUNARODNIM BIOBAZAMA

i povezivanja sa sličnim istraživanjima u svrhu suradnje i unaprijeđenja znanja za opće dobro.

MOGUĆNOST DOBROVOLJNOG ONLINE ISKAZIVANJA MIŠLJENJA

svih sudionika istraživanja o iskustvu, značaju i učinku analize cijelog genoma (za dijete, za obitelj, za liječnika, za zdravstveni sustav, za širu društvenu zajednicu).

INTERVALNA REANALIZA I REINTERPRETACIJA ODABRANIH VARIJANTI

u djeteta u skladu s novim i naprednim znanjima i tehnologijom te traganje za biološki značajnim rijetkim varijantama (mutagenost) uz pomoć digitalne medicine i umjetne inteligencije.

MOGUĆNOST NAKNADNOG OČITANJA I INTERPRETACIJE GENOMSKIH VARIJANTI

s presimptomatskim predviđanjem za roditelje i to za varijante gena koji su na popisu ACMG i čije otkrivanje ima potencijal ranog otkrivanja i transformiranja tijeka bolesti.

MOGUĆNOST NAKNADNIH FUNKCIJSKIH ISTRAŽIVANJA I ANALIZA

pojedinačnih rijetkih varijanti i polimorfnih lokusa (evolucijski otisci) s generiranjem i testiranjem znanstveno-istraživačkih hipoteza.

Pozivamo Vas na suradnju i stojimo Vam na raspolaganju. Materijale možete preuzeti na sljedećoj poveznici: CroSeq materijali

Hvala Vam lijepa.

Prof.dr.sc. Mario Ćuk